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    公开号:WO1985003086A1
    申请号:PCT/JP1985/000004
    申请日:1985-01-09
    公开日:1985-07-18
    发明作者:Shigekazu Nagata；Rikirou Fukunaga；Yoshihiro Soukawa；Yoshito Kajiro
    申请人:Suntory Limited；
    IPC主号:C07K14-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 糖付加ホミリぺプチド'の製造法
    [0003] (技術分野）
    [0004] 本発明は糖付加 リペプチドの製造法に関する。 さらに詳し くは 霊長類ウィルスのプロモーター支配下に恒常的に発現で きるように目的 リペプチドをコードする遣伝子が組みこまれ た牛パピローマウイルス由来の D N Aによって形質転換された 哺乳動物細胞を培養し、 その培養液から採取することから る 糖付加'十ミリべプチ の製造法および該^リぺプチ を含有する 培養組成物に関する。
    [0005] (背景技術）
    [0006] 近年、 組換え D N A技術（以下 rDNA技術と略す）を用いて 有用 ¾生理活性物質を生産しようとする試みが多くなされ、 そ の基本的手法はほ 確立されていると言える。 しかし、 その技 術の実用化に際しては、 質的。量的にまだ解決しなければなら ない問題が多く残されている。
    [0007] 例えば 質的面では、 天然の生理活性物質にしばしば見出さ れる糖蛋白の生産技術はまだ確立されているとは言えない。 こ れまで r DNA 技術を用いた有用物質の生産には、 原核生物であ る大腸菌や枯草菌 ¾どの細菌類が宿主細胞として広く用いられ てきているが、 これらの微生物宿主によって糖蛋白をつくるこ とはでき い。 そこで、 近年糖蛋白をつくる能力 ¾有する有核 細胞、 例えば酵母や動物細胞を宿主とした研究が行われるよう になってきた。 しかし、 未だ実用化できるような宿主。ベクタ 一系が磾 れて るとは考えられない。 例えば、 ァカゲザル 由来の Simian Virus 4 0 (以下 S 7 4 0 と略す） に異種 DNA を連結したものを、 COS 細胞のようなサル細胞に導入し、 そ の細胞を培養することによ D目的とする外来蛋白もしくは^リ ぺプチド¾生産しようとする試みがなされているが（Hamer, D.H. C Nature, 281 ： 35〜40、 1 9 7 9 , Gruss,P. ら
    [0008] Proc. Natl.Acad.Sci. US A7 8 : 1 3 3〜 1 3 7、 1981， Gray. P.Wら aimre 29 5 : 5 0 3〜5 0 8 、 1 98 2、 Devos, R. ら Nucl.Acid. Res. 1 0 : 2 4 8 7〜 2 5 0 1 , 1982)、 (1) 揷入される異種！） N Ac 大きさや用いられる宿主細胞が限 られること (ii) 形質転換が困難なこと (iii) たとえ形質転換され ても、 導入された D N Aが所謂ウィルスとして働くため宿主細 胞を死に至らしめることがあること、 （ ι) そのため目的とする 外来蛋白遺伝子の発現量が充分で ¾いこと どの欠点があった。 近年、 これらの欠点のいくつかは新らしいベクターの開発
    [0009] (Lowy.D.R. ら Nature 2 8 7 : 7 2〜 7 1 9 8 0、 Sarver,
    [0010] N . b Mo 1. Cellular Biol. 丄 ： 4 8 6〜 4 9 6 , 1 9 8 1 )に よ D克服されてきているが、 まだ実用に供するほど充分である とは言えない。
    [0011] 本発明者らは、 上記の欠点を補い且つ実用に供しうるような 宿主。ベクター系を確立すべく鋭意研究を行った結果、 マウス 乳癌細胞を宿主とし、 S V 4 0の初期蛋白遣伝子のプロモータ - ( S V 0 early promoter) の支配下に目的外来遺伝子が 発現できるような牛パヒ。口一マウイルス遺伝子を含む D N Aを ベクターとして用いることが、 糖蛋白（特にヒ ト 。ガンマイ ン ターフェロ ン ）を大量且つ安定に生産しうることを見出し本発 明を完成するに至った。
    [0012] (発明の開示）
    [0013] 本発明は霊長類ウイルスのプロモーター支配下に恒常的に発 現できるように^リぺプチド遺伝子が組みこまれた牛パビロー マウィル由来 D NA によって形質転換された哺乳動物細胞を 培養し、 その培養液から目的とする蛋白質 ¾採取すること ¾特 徵とする糖付加^リぺプチドの裟造法を提供するものである。
    [0014] 本明細書における 「糖付加 リペプチド」 の語は、 糖蛋白と して存在しうる リぺプチドが、 本発明の方法によれば実際に 糖部分 ¾有する状態で製造されることを意味する。
    [0015] 上記霊長類ウィルスのプロモータ一として特に好ましいもの の一例は、 S V 4 0の初期蛋白のプロモータ一である。
    [0016] 本発明の方法は、 ホリペプチ ド、遺伝子として例えぱヒト ' ィ ンターフェロンをコードする遺伝子を使用し 糖付加ヒ ト · ィ ンターフェロ ン（特にヒ ト 。 ガンマイ ンタ一フエロン ） ¾哺乳 動物細胞で製造するために有用である。 本発明の方法は、 糖部 分 ¾有する他の種々の リぺプチドの製造にも応用できると期 待される。
    [0017] 本発明の方法によ ヒ ト 。 ガンマイ ンターフエ口 ンを製造す る場合に、 該ィ ンターフェ口ンの遺伝子として、 例えばヒ ト脾 臓細胞もしくはヒ ト リ ンパ球からのメッセンジャー R N A を铸 型としてつく られたヒ ト · ガンマイ ンターフェ口ン遺伝子が都 合良く使用できる。
    [0018] 上記ボリぺプチド遺伝子 ¾組込む牛パピロ一マウィ ルス由来 D N A およびその組込み方法については、 後記の実施例等に詳 述するが、 本発明はこれらに限定されるものでは ¾い。
    [0019] 本発明の方法に使用する哺乳動物細胞は、 原則として上記牛 パピローマウィルス由来 DNA によって形質転換されうるもの であれば任意の細胞であってよく、 例えばマウス由来の細胞が あげられる。
    [0020] ( 図面の簡単な説明 ）
    [0021] 第 1図は、 ヒ ト 。 ガンマイ ンターフ ェロン OiOT-iT)のカル ボキシル基末端近傍のァミノ酸配列とそれに対応する塩基配列 ならびに mRNA分錐のために用いたィ匕学合成 DNA プ ローブの塩基配列（下段四角枠内） ¾示す。
    [0022] 第 2図は、 クローン化された hIF -r cDNA の制限酵素地図 および ρΓ-30 ODNA ¾プローブとして Okayama-Berg法に よって得られ 7tiiIFN-r cDNA(Pr-1002 と ρΓ - 1018)から 完全な長さの iiIFN-r遺伝子をもつプラスミ ド pIFrの造成法 の概略 ¾示す。
    [0023] 第 3図は、 COS- 1細胞での tJFN - * 遣伝子発現ベクター pdKCR-IFN の造成法の概略 ¾示す。
    [0024] 第 4図は、 マウス乳癌細胞での iiIFN-r 遣伝子発現べクタ - pFNr の造成法の概略 ¾示す。
    [0025] 第 5図は、 形質転換細胞の 1つである F Γ 5 6の培養時にお ける細胞数と抗ウイルス活性との関係 ¾示す。
    [0026] 第 6図は、 培地中の仔牛血清（FCS) 濃度の liIFN- " の生 産におよぼす影響 ¾示す。
    [0027] (発明 ¾実施するための最良の形態）
    [0028] 本発明における製造の対象と ¾る糖蛋白の 1つであるヒ ト · ガンマインターフェロン（以下 hlFN-r と略す） の遺伝子は, Graj,P.W. ら （Nature 29 5 : 5 0 3〜5 08 , 1 9 8 2 ) および]) evos ,R. ら （Nucl,Acid,Res.1 0 ： 248 7〜
    [0029] 2 5 0 1、 1 98 2 )によ ] 既にクローニングされその DNA 配 列が明らかにされているが、 本発明者らも独自に、 ヒ ト脾臓細 胞が生成する mRNA を篛型としてつく られた cDNA をクロー- ングすることによって 遣伝子を得た。 即ち、 まず SEA (Staphylococcal ante ro toxin A) 存在下に培養し たヒ ト脾臓細胞が生成する mRNA から通常よく用いられる Hoei jmokers らの方法 xioei jmokers， J.H.J , ら、 υθΐΐθ 8 ： 3 9 1〜 4 1 7 , 1 9 8 0 )を用いて cDNA ノミンクをつく 、 化学合成オリ ゴヌクレオチ ド ¾プローブとして liIFN-r cDNA断片を得た。 次に、 得られた cDNA断片の 1つ ¾プロー
    [0030] H. 8c Berg, P. , Mol .Cell. Biol. 2 : 1 6 1〜； L 70、 1 9 8 2 ) を用いて つく られた cDNA パンクよ ] 再び cDNA断片を分離 し、 さらにそれらの DNA 断片を適当に連結することによ 完 全る長さ ¾もつ iiIFN-r遣伝子（Hu-IFN - r cDNA) を得た
    [0031] (第 2図参照）。
    [0032] 次に、 上記の如く して得られた遺伝子が liIFN- 遺伝子であ ること ¾確かめるため、 得られた遺伝子 ¾、 ゥサギの グロ ビン遺伝子、 S "V 4 0 DNA および pBR322 DNA 誘導体 (pML-i) を含む雑種プラスミ ド、 pdKCR ( フラ ンス、 ス ト ラス ブルグのェ NSERM 研究所の Dr .Breatlinacli ょ 譲受）の BamHエ サイ トに挿入し（第 3図参照）、 カルシウムフォスフ エイ ト法（Wigier ,Μ. ら， Cell 14 : 725〜 73 1 , 1 9 7 8 )を用いてサル細胞由来の COS- I 細胞（米国、 Cold Spring Har¾ o r研究所の Dr . Giuzman よ ]5譲受） ¾形質転換した。 続いて該形質転換細胞を培養し、 培養液につ て抗ウィ ルス活性を Yip らの方法（Yip.Y.K, ら、 ； Proc. Natl. Acad. Sci .USA7 8 : 1601〜1 605 . 1981 ) に従い測定した結果、 抗イ ンタ一フエ口ン αおよび抗ィンタ一 フエロ ン^抗体処理では失活しな が抗 lxIFN-r抗体 では 失活する抗ウィ ルス活性が観察された。 即ち、 上記で得た遺伝 子カ ixIFN-rの遺伝子であることが確められた。 しかし、 この 形質転換細胞の 生産能は一過性であ] 、 この方法 ¾ hIFN-r生産法として実用化に供するには不適当であった。 そこで、 本発明者らは、 上記で得た iiIFN-T "遺伝子を含む D IT A断片を新たなプラスミ ド、 pdBPV- 1 〔牛パピ口一マウイ ルス： D NAおよび pBR 322 からの誘導体（pLM- 2 ) 力 ¾ら る雑種プラスミ ド、： National Cancer Institute , Betliesda Ο Dr .Peter M.Howley よ嫌受： このプラス ミ ド、 dBPV-1 は、 ATCC/¾ 37 1 3 4として大腸菌 HBiOl ( ATCC y¾ 3 36 9 4 )を宿主としてアメ リカン タイプ カルチユア コレクショ ンに寄託されている。 〕 の Hin 1H
    [0033] - i uIIサイ トに挿入し、 pBR322 由来の pML-2 領域 ¾除 去後、 カルシ ウムフォスフェー ト法〔前述） ¾用いてマウス C 1 2 7ェ細胞（アメ リ カン タイプ 力ルチユア コ レクショ ンょ 購入： ATCC /¾CRL 1616 として寄託されている ） 形質転換した（第 4図参照）。 続いて、 該形質転換侏 ¾培養 し、 培養液中に分泌される 量を抗ゥィルス活性によつ て測定したところ、 形質転換株によ ] 生産量は異なるが、 得ら れた形質転換株の 8 0 以上に抗ウィルス活性が認められ ¾ 特 にその内の数株の培養液の抗ゥィルス活性は約 4.5 X 1 0 5 ュ ニッ ト //^という顕著に高い生産量であった。 これまでこのよ うに高い生産能を示す洙は動物細胞 ¾宿主とした組換え体では 見当らない。 また、 本発明において造成されたプラスミ ド ( FNr：第 4図参照）は、 上記宿主細胞内に多量（細胞当] 2 0〜 5 0コビ一）存在し且つ安定に複製されることも、 Southern の方法 (S outhe rn liy"bridi za cm :Soutlierii
    [0034] E .M. , J.Mol .Biol. 9 8 ： 5 0 3 , 1 9 75 ) によって確認 された。
    [0035] 本発明における形質転換株が生産する hlFN-r リぺプチ に糖鎖が付加されていることは、 該活性物質が ConA セファ ローズに吸着されること、 S D S リアク リ ルア ミ ド、電気泳動 法においてその推定分子量が 2 0,0 0 0から 2 5, 0 0 0である こと （純' リぺプチドであるなら分子量は約 1 7， 0 0 0 ) ¾ど の結果からまちがいないと考えられる。
    [0036] 以上の如く、 本発明における宿主 ' ベクタ一とした糖蛋白製 造法の特徴として、 目的外来遺伝子が恒常的に発現できるよう に組みこまれたプラスミ ド、のコビー数が高く且つェピゾミ ック D N Aとして安定に複製されること、 生産しようとする物質が 糖蛋白として多量に培地中に分泌されること、 従って連続的培 養が可能であることなどが挙げられ、 実用化に充分供しうるも のである。 以上、 製造しようとする物質としてヒ ト 。 ガンマイ ンターフ ェロ ン （iiIFN-r) ¾例にして述べてきたが、 本発明における 製造法では該物質に限らず他の糖蛋白、 例えばヒ ト . -イ ン ターフェロ ンゃヒ ト 外のイ ンターフェロン、 またイ ンター口 ィ キン 1， 2， 3，TNF (tumor necro sis factor: ガン破壊因 十 ソ 、 C S F (colony s t im lat ing factor ： コ 口 二一 剌激因子） などのリンフォカインゃ種々の糖鎖のついたホルモ ン類さらには抗体等の生産にも適用できることは明らかである c また、 宿主細胞も上に述べたマウス乳癌細胞に限らず、 該プラ スミ ド D N A ¾受け入れられる細胞であれば他の確立された動 物細胞ラィンをも用いることができる。
    [0037] 以下、 実施例 ¾もって本発明 ¾さらに詳しく説明するが、 本 発明はこれらに限定されるものではな 。
    [0038] 尚、 本発明において材料として用 たプラスミ ドおよび細胞 は、 既述した譲渡 ¾受けた先から入手することが可能である。 く実施例〉
    [0039] 1. ヒ ト 。 ガンマインターフェロ ン （hlFN - Γ) 遺伝子のクロ一 ユング
    [0040] ヒ ト脾臓細胞（ 1- 0 X 1 0 10cells) ¾牛血清 5 および S E A (Staphylococcal enterotoxin A) 0.0 2 - ¾含む RPMI 1 64 0培地で 3 7 で 6 0時閫培養後、
    [0041] Chirg in らの方法〔Clii rgwin， J" , Μ· ら、 Biochemistry 1 8 : 5 2 9 4〜 5 2 9 9、 1 9 7 9 )に従い R N A ( 4^ ) ¾抽出した。 次に、 ^リ ARNA をオリ ゴ T -セルロースカラ 厶クロマトグラフィ によ 分錐し（Aviv, H. ら、 Proc.Natl. Acad. Sci .USA , 6 9 ： 1 4 0 8〜 1 4 1 2 ， 1 9 7 2参照）、 続いて 5 0 mM ト リス塩翳 pH 7.5 , 0.2 M NaC ，0.1 ^ s odium N - lauroァ lsarc os ine および 1 mM EDTAを含 む 5 %から 2 5 の直線的庶糖密度勾配遠心（ 26，000 rpm、 1 9時間） ¾ 4 °Cで日立 0 ロータ一を用い行った。各 分画（ 0.2 ) をエタノール沈殿法によ 濃縮後、 その 1/20 量をアフ リ カッメガエルの卵 (Xenopus oocyte s) に注入す ることによ 蛋白質 ¾合成させ（Gurdon，J.B .ら、 J.Moiec. Biol . 8 0 : 5 3 9〜 5 5 1、 1 9 7 5参照）、 その生産物中 の抗ウィ ルス活性を測定した。 その結果、 1 5 Sに相当する分 画に抗ゥィルス活性がみられたのでその画分を集め、 iiIFN-r mRNA ¾含む分画と して以下の の cDNA合成に用い た。
    [0042] 上記の庶糖密度勾配遠心によ 1 精製された mRNA( 2 0 μ9 ) 力 ら、 Ho Θ i jmaker s ら §d載の方;去 (Ho Θ i jmake rs、 J. H.J . ら、 Gene 8 : 3 9 1〜 4 1 7、 1 9 8 0 ) に従い、 G - C ' tail 法によって pBR 3 2 2 に連結された二重鎖 cDNA
    [0043] ( 0.2 4 ^) を調製し、 この DNA 用い E.coii を形質転 換しテ トラサイクリ ン耐性 ¾示す形質耘換株 4, 0 0 0クローン ¾得た。 続いて nIFN- Γ の c!DNA をもつクロ一ン¾選択する ため、 第 1図に示したような 1 4 mer の 3 2 Pでラベル^ τた ヌクレオチドをプロ一ブとしてコロ ニ一ノ、イブリ ^^ィ ジェイシ ヨンを行った。 上記の D Ν Αプローブの塩基配列は Gray ら (Gray, P.W. ら、 Nature 2 9 5 : 5 0 3〜 5 0 8 , 1 982 ) によって示された の D A配列 ¾参照してデザィ ンし、 化学的に合成された（第 1図参照）。 該化学合成ヌクレオチ は MS機器よ D購入した。
    [0044] 4,0 0 0個のテトラサイクリ ン耐性 ¾示す形質転換株から、 コ ロニー 、ィ ブリ ダイジェイシヨンによって 4侏のホミジティ ブ クローン ¾得た。 続いて、 該^ジティ ブク口ーンのプラスミ ド ¾分錐し、 Gray らおよび: Devos ら（いずれも文献名前述） の塩基配列データをもとに、 制限酵素切断による解析 ¾行つた。 その結果、 最高 3 0 0 ¾ から ¾る liIFN-rの CDNA しか得 られていないことがわかった（完全な長さの iiIFN-Γ DNA は 最低 5 0 0 ¾p 以上が必要である）。 そこで、 約 3 0 0ヌクレ ォチドをもつ liIFN-r cDNA ¾ρΓ300と名ずけ、 この cDNA ¾用いて再び cDNA パンクから iiIFN-Γ cDNA の分錐 ¾行つ た。
    [0045] 今回の cDNA パンクは庶糖密度遠心によって得られた リ A RNA ( 3 ) 力 ら Otayama-Berg法（Okaァ ama， H. & Berg, P. , Mol. Cell. Biol. 2 ： 1 6丄〜 1 70 ， 19 82 )によ つく られた。 ΡΓ300 をプローブとして、 前述と同様の方法で コロニ一ハイ ブリ ダ、イ ジエイシヨ ン ¾行い、 6 0 0 01固の
    [0046] E.coii 形質転換株力 ら hIFN-7" cDNA ¾もつクローン 2珠 得、 該 cDNA を各々 002、 ρΓ- 1018とした。 前述 と同様にこれらのクローンのプラスミ ドを解析した結果、 第 2 図に示すように、 いずれも； ρ了 300 ょ は大きな cDNAが得ら れたカ Pr-1002 は liIFN-7*DNA の 5 ,末伺 ί；^、 νϊ- 1 0 18はその 3 ' 末側が欠失した cDNA であることがわかつ た。 そこで、 第 2図に示したように、 ρΓ- 1002 からの EcoRI -PvuE 断片①（Ampr を含む） と Hinfl-PvuIT 断片②、 お よび ΡΓ— 1018からの EcoRI-Hinfl断片③ (Ampr を含まな ^ ) ¾T 4DNA ライ ゲースによって違結せしめることによ , 完全 ¾長さをもつ liIFIT-T" 遣伝子をもつプラスミ ド pIF " ¾ 造成した。 E.coii に導入された pIFrプラスミ ドについて目 的とする cDNA 領域即ち hlFN - 遺伝子領域の制限酵素地図 をつくった結果、 Gray ら （文献前述）の示した制限酵素地図 と同一であった。
    [0047] 2. _ サル C 0 S - _ι細胞での HIFN- r 遺伝子の発現
    [0048] 実施例 1で得た liIFN-Γ遣伝子が、 動物細胞中で発現し、 iiIFN-r ^リぺプチド¾生成するか否かをチェックするため 以下の実験を行った。
    [0049] 発現べクタ一としては、 INSERM 研究所 （ フランス、 ス ト ラスブルグ）の Dr .Breatlmacli よ 譲受したプラスミ ド pdKCR ¾用いた。 pdKCRは S V 4 0の複^開始領域の A、 兎の ^ - グロ ビン遺伝子ならびに pBR 322由来の Amp r (ァ ン ピシリ ン耐性）遺伝子を含む！） N A断片からなるプラスミ ド であ D、 このプラスミ ドの BamHエ サイ トに異; itDNA ¾挿入 すると S V 4 0初期蛋白遺伝子のプロモータ一支配下に該異種 DNA カ C0S- 1細胞内で発現でき るようになつている （第 3 図参照）。 そこで本発明者らは、 実施例 Iで得た iiIFN-r遺伝 子をもつプラスミ ド' pIFr 制限酵素 Sau3AIで切断して得ら れる 8 5 0 p の Sau 3 A DNA 断片 ¾、 pdKCR プラスミ ド、 €> BamHI サイ トに挿入した発現ベクター pdKCR - IFN ¾造 成した（第 3図）。 続いて、 上記べクタ一を制限酵素 Hhal で 処理して pBR322 由来の DNA (PMLl 領域）を除去した後、 カルシウ ム - フォスフェイ ト法（Wigier ,Μ· ら、 Cell 14: 725〜731 , 1978 ) ¾用い COS- 1細胞（米国、 Cold Spring Harbor研究所の Dr · Glioma nよ ])譲受）の形質転 換¾行った。 また、 コン ト ロールとして iiIF - *遺伝子を含ま ない pdKCR も同様に COS- 1細胞に導入した。 プラス ミ ド p KCR-IFNおよび pdKCRで各々形質転換され た COS- 1細胞を、 仔牛血清 1 0 を含む DMEM (日水製案 社製、 ダルベッ コ変法イ ーグル培地 「ニッスィ」 ）培地で 9 0 時間 3 7 で培養後、 培養液の抗ウィルス活性を調べた。 その 結果、 pdKCR-IFNによって形質転換された細胞の培養液にの み抗ガンマイ ンターフ ェロン抗体処理で失活する抗ウイ ルス活 性がみられ（第 1表参照）、 実施例 1で得た pIFr が確かに nIFN- 遺伝子を有していることが認められた。 第 1 表
    [0050] COS- 1細胞産生ィンタ一フエロンの同定 プラスミ ト、、 コントロール 抗インタ一フエロン 抗インターフェロン 血清 血清 pd CR く 10 n . t . n . t .
    [0051] pd CR- ira 1.250 1.150 16 n„ . ： テス 卜せず 上記の如く、 piKCR-IFN プラスミ で形質転換された C0S-1 胞でも nIF -r は生産されたが、 形質転換された 細胞が早急に死滅するため、 iiIFN-Γは一過的に生産されるの みであ] 、 この系が実用化に供されるには不充分である。 そこ で、 安定に高生産する細胞の造成を次に行った。
    [0052] 3. 一安定に高生産する細胞の造成
    [0053] 高いコピー数をもち安定に複製できるブラスミ ドベクターと して- National Cancer ェ ns titute U A < Dr .Peter M.Howly よ ] 譲受されたフ。ラス ミ ド p EPV- 1 ¾用いた。 pdB V-l は、 マウス細胞中で高いコピー数 （細胞 当 5 0〜； L 0 0 ) ¾保ちながら複製ができる牛パピロ一マウ ィルスの DNAと pBR322 由来の pML-2 ベクター DN A と
    [0054] ¾もつ雑種プラスミ ド、である。
    [0055] マウス細胞中で高いコヒ。一数 ¾保ち安定に hJFN-rを生産す るブラス ミ ド pFNr は第 4図に示す如く して造成された。 即ち、 pdBPV-i ¾ HindlEと; Pvul [処理して、 牛パピ口一マウィル スの後期蛋白遺伝子領域（第 4図中 L iの全部と L 2の一部分） ¾除き、 そこに先に得た pdKCR-IFN の liIFN-T* 遣伝子領域 ¾含んでいる Hiniffl -Thai 断片を挿入することによ 得られた。 次に、 このプラスミ ド、 pFNr ¾ BamHI で難して pBR 3 2 2 由来の pML-2 領域 ¾除去した後、 カルシウ ム - フォスフェイ ト法（前述） を用いマ ウス細胞 C 1 2 7 1を形質 転換した。 コン ト ロールとして BamHI で処理されたプラスミ.ド pdBPV-l も同様に形質転換に供した。 細胞は仔牛血清 1 0 ¾含む DMEM 培地 ¾ 3 日毎に変えながら培養し、 1 6 日目に フォーカスとして観察される形質転換侏 ¾ cell line (細胞ラ イ ン ） と して確立した。
    [0056] BamHI で処理後の pFNf DNA による C l 2 7 l細胞の形質 転換の頻度は、 同様に BamHI で処理された pdBPV-lの場合よ 約 1 5分 1程度であつたが、 l O ^ D N A 当 D 3 3個の形 寫転換株が得られた。 上記のようにして得られた pFNr Ώ Α による計 5 6鎖の形質転換株の培養上清について抗ウイルス活 性物質（即ち liIFN-n 生産能を既述と同様な方法で測定した 結果、 4 5 ί固の形質転換細胞の培養液中に活性の大小はみられ たが明らかに抗ウイルス活性が認められた。
    [0057] 続 て、 上記で得られた高活性 ¾示した形質転換株の 1つで ある F 5 6につ てさらに詳しく 生産能 ¾調べた。
    [0058] 5 X 1 0 5 個の細胞 ¾仔牛血清 ¾ 1 0 含む D ME M 培地 （直 径 5 cmのぺト リ皿）に接種し 3 7 で培養した。 細胞数を 2日 目毎に、 イ ンターフェロ ン活性（抗ウィ ルス活性） ¾毎日測定 した（第 5図参照）。 第 5図から明らかなように、 抗ウィルス 活性は培養 4日目までは細胞数に比例して上昇し、 その活性は 培養 4日目以降細胞数がほ —定となったあとも上昇 ¾続けた c そして、 培養 6日目の抗ウィルス活性は驚くべきことに 5 X 1 0 "ュニッ ト Z にも達した。
    [0059] 次に、 iiIFN- Γ の生産に及ぼす培地中の血清濃度についても 調べた。 F 5 6 を上記と同じ条件で培養し、 細胞数がそれ以 上増加し ¾い時点で（ほ:^培養 4日目 ）、 培地 ¾仔牛血清 ¾含 まない: D M E M培地、 仔牛血清を各々 1 %、 1 0 %含む DMEM 培地で置き換え 3 7 でさらに培養 ¾行つた。 各々の培養に対 し毎日培地中の抗ウィルス活性を調べた結果、 第 6図に示すよ うに、 培養 3日目までは仔牛血清を 1 %含む培地と該血清 ¾ 1 0 含む培地ともほ^:同様に培地中の抗ウィルス活性は上 昇し、 該血清を 1 0 を含む培地では 3日目に、 該血清 ¾ 1 含む培地では 4日目に該活性は 1 当 ] 4.5 X 1 0 5 ユニ ッ ト に達した。 —方、 該血清を含まない培地ではイ ンターフ ェロ ン 活性は培養に従ってゆつく 上昇し、 5 日目には 3 X 1 0 5ュ -ッ ト に達した。
    [0060] 上記の結果は、 本発明において造成されたプラスミ ドが安定 に宿主細胞中に保たれながら揷入された外来遺伝子が非常に効 率よく発現していること ¾示している。 即ち、 本発明における 形質転換細胞は、 本実施例に例示した laIFN-Γ のような外来 蛋白を安定に且つ効率よく連続的に生産できること ¾示し、 本 発明の細胞が充分外来蛋白の実用的生産に供しうることを示し ている。
    [0061] 4. の部分精製と物理化学的性質
    [0062] 実施例 3で得た F γ 5 6細胞を仔牛血清を 1 0 含む DMEM 培地で培養し、 細胞数がほ 一定になった時点で、 1 0 0 €i の 35S -メチ才ニンと透析した仔牛血清 ¾ 1 0 含むがメチォ ニン ¾含まない 0.5 ^の MEM 培地（ 日水製薬社製、 イーグル M E M培地 「ニッスィ」 ）に移し、 さらに 3 7 で培養した。 2 0時間の培養後、 遠心分離によ J9得た培地上情（ 0.5 ^ )に 2 5 ^0 のコ ン ト 口一ル ドボァガラス （controlled poreglass) CPG- 00350, 120Z 200メッシュ〔フナコシ案 品社よ 購入）を加え 4 °C—夜混合した。 次に、 上記 アグラ ス （以下 CPG ビーズと略す） ¾遠心分離によ 集め、 ： PBS バッファー（ 1 5 0 mM aC^ ¾含む 2 0 mM リ ン酸ナ ト リ ウ ム緩衝液、 pH 7.4) で充分洗浄後、 CPG ビーズに吸着して いる hIFN-7* ¾ 0.4 Mテ ト ラメチルアンモユウムクロ ライ ド¾ 含む; PBS バッファ一で溶出した。 この操作における nIFN-Γ の回収率は 9 0 以上であった。
    [0063] 続いて、 C P Gビーズからの溶出液（ 0.3 )を 0.2/^の CoiiA-セファロース （フアルマシア ファイ ンケミカル社製） 力 ラムにかけ、 2 5倍量の P B Sパッファーでカラムを洗浄した。 ConA-セファロースに吸着された iiIFN-ァ は 4 6 ^の回収率 で 0.1 Mo: -メチル - D -マンノシド溶液にょ 溶出された。 この溶出液 ¾部分精製 HlFN-rとし、 標準蛋白 ¾マーカー と した 1 5 % SDS ホリァクリルァミ ド電気泳動による解析を行つ た。 その結果、 上記部分精製 liIFN-rは分子量が 2 0，00 0か ら 25，0 0 0に相当するところに広いパンド、として観察された。 —方、 HlFN-Γ のホリペプチド部分は Gray らの報告（Gray, P.W. ら Nature 295 : 503〜 508, 1982) によると 1 46個のアミノ酸残基からな 、 その分子量は約 1 7,0 00 ¾>る。
    [0064] これらの結果、 即ち 目的とする蛋白（liIFN- ) が ConA- セファロースに吸着されることおよび分子量が 2 0，0 0 0から
    [0065] 2 5, 00 0の範囲にあることから、 F Γ 5 6細胞から生成され る iilFN-T"は糖鎖が付加された蛋白であることが強く示唆され た。
    [0066] 尚、 本発明においてクローン化した liIFN- 遣伝子にはシグ ナルペプチド（ 2 0個のァミノ酸残基から ¾る） ¾コードする D N A領域も含まれているが、 本実施例で用い 宿主細胞 C 1 2 7ェでは、 Sarver らの報告（Sar ve r , N . ら、 Mol · Cell .Biol. 1 : 486〜496、 1981 ) に示されている よ うに、 シグナルペプチド部分はプロセッシングされ、 生成さ れた^リぺプチド部分は成熟した^リぺプチド'鎖即ち分子量が 約 1 7， 0 0 0の^リぺフ。チド 'になっているものと考えられる。
    权利要求:
    Claims

    請求の範囲
    霊長類ウィルスのプロモータ一支配下に恒常的に発現でき るように^リぺプチド遗伝子が組みこまれた牛パピローマウ ィ ルス由来 D Aによって形質転換された哺乳動物細胞を培 養し、 その培養液から目的とする蛋白質を採取すること ¾特 徵とする糖付加^リぺプチドの製造法。
    霊長類ウィ ルスが S V 0であること ¾特徵とする請求の 範囲第 1項記載の製造法。
    フ。口モーターが S V 4 0の初期蛋白のプロモーターである ことを特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造法。
    ^ リ ぺプチド、遣伝子カ ヒ ト 。 イ ンターフエ口 ンをコ一ド、す る遣伝子であることを特徵とする請求の範囲第 1項記載の製 ホリぺプチド、遺伝子がヒ ト · ガンマイ ンターフエ口ン遣伝 子であること ¾特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造法。
    リぺプチド遣伝子が、 ヒ ト脾臓細胞もしくはヒ ト リ ンパ 球からのメ ッセンジャー RNA を踌型としてつく られたヒ トガンマイ ンターフエ口 ン遺伝子であることを特徵とする請求 の範囲第 1項記載の製造法。
    形質転換された哺乳動物細胞がマウス由来の細胞であるこ と ¾特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造法。
    糖付加 リぺプチドがィンターフェ口ン活性を有すること
    ¾特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造法。
    糖付加^リペプチドがヒ ト 。 ガンマイ ンターフェロ ンであ ることを特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造法。 0 霊長類ウイ ルスのプロモータ一支配下に発現できるように ^リベプチド遺伝子が組みこまれた牛パヒ。ロ ー マウィ ルス由 来 D N Aが、 pENr で表わされるプラスミ ド D N Aであるこ とを特徴とする請求の範囲第 1項記載の製造法。
    1 霊長類ウィ ルスのプロモーター支配下に発現できるように ホリぺプチド遺伝子が組みこまれた牛パヒ。 ローマウイルス由 来 D Aによって形質転換された哺乳動物細胞が V 56 で表 わされることを特徵とする請求の範囲第 1項記載の製造法。
    プラスミ ド pFNrによって形質転換されたマウス細胞を培 養し、 その培養液から得られる糖付加ヒ ト · ガンマイ ンタ一 フエ口 ン含有組成物。
    プラスミ ド pFNrによって形質転換されたマウス細胞が Fr56 で表わされることを特徴とする請求の範囲第 1 2項記 載の組成物。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP0169907A1|1986-02-05|
    JPS60145098A|1985-07-31|
    EP0169907A4|1986-07-24|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1985-07-18| AK| Designated states|Designated state(s): US |
    1985-07-18| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB LU NL SE |
    1985-09-09| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985900730 Country of ref document: EP |
    1986-02-05| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985900730 Country of ref document: EP |
    1988-12-20| WWW| Wipo information: withdrawn in national office|Ref document number: 1985900730 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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